摘要：目的应用网络药理学和分子对接方法，对鲜竹沥发挥“咳、喘、痰”作用的机制及潜在的质量标志物（qualitymarker，Q-Marker）预测分析。方法采用干馏法和火烤法制备鲜竹沥，对鲜竹沥的指纹图谱进行研究，筛选并预测其中14个成分的潜在作用靶点及通路，结合文献数据库分析确定“咳、喘、痰”病症的靶基因；取药物与疾病交集基因，将交集基因上传String数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-proteininteraction，PPI）分析，利用Rstudio的clusterProfiler功能对交集基因进行基因本体（geneontology，GO）功能及京都基因与基因组百科全书（Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG）通路富集分析；预测鲜竹沥的Q-Marker，并运用分子对接软件对部分关键靶点及其对应成分进行分子对接，验证网络分析结果。结果采用指纹图谱研究得到8批干馏法、火烤法的鲜竹沥主要活性成分，经网络药理学及分子对接分析鲜竹沥对“咳、喘、痰”病症的治疗作用，推测鲜竹沥的Q-Marker为香草酸、对乙基苯酚、丁香醛、二氢丁香酚、对乙烯基愈创木酚，主要通过调节炎症反应、环磷酸腺苷（cyclicadenosinemonophosphate，cAMP）信号通路、缺氧诱导因子-1α（hypoxia-induciblefactor-1α，HIF-1α）信号通路、血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）信号通路等重要生物通路来发挥止咳、平喘、化痰的作用。结论通过预测鲜竹沥的Q-Marker，为提升其质量控制标准奠定了基础，同时也为鲜竹沥功效关联物质的研究及作用机制的阐释提供参考，为其二次开发以及扩大临床使用范围提供参考依据。
竹子为禾本科多年生常绿乔木状植物，其分布广、品种多，在世界范围内约87个属、多个种。鲜竹沥为禾本科植物粉绿竹PhyllostachysglaucaMcClure、净竹P.nudaMcClure及同属数种植物的鲜杆经加热后自然沥出的液体，性味甘、苦、寒，入心、胃经，具有清热化痰、镇惊利窍之功效，鲜竹沥在古代被中医誉为“痰家圣剂”，《神农本草经》记载：“竹叶，味苦平，主咳逆上气溢筋急，恶疡，小虫；竹根，益气止渴，补虚下气；竹汁，主风庢实，通神明，轻身益气”[1]。临床多用于治疗肺热咳嗽痰多、气喘胸闷、中风舌强、痰涎壅盛、小儿痰热惊风等症[2]。鲜竹沥是中药品种鲜竹沥口服液、复方鲜竹沥液的主要原料药，也是竹类植物在临床上常用的药用制剂。鲜竹沥的古法炮制工艺有烧制法和干馏法，分别载于唐朝《急备千金药方》[3]：“取淡竹断两头节，火烧中央，器盛两头得汁”；明朝《本草纲目》[4]：“以竹截长五六寸，以瓶盛，倒悬，下用一器承之，周围以炭火逼之，其油沥于器也”。
鲜竹沥化学成分复杂，主要含有挥发性成分、氨基酸、*酮类成分、维生素及微量元素等。据国家药品监督管理局统计，处方中含鲜竹沥的中成药有16种（包括去痰灵口服液、沥水调脂胶囊等），含鲜竹沥的中药方剂有81条（包括阿胶饮子、八仙膏、白术和中汤等）。同时，鲜竹沥也被开发成具有一定食用价值的饮料（包括鲜竹沥饮料、蛇胆枇杷沥、无花果饮料等）。但目前鲜竹沥现行质量标准水平较低，导致市售产品存在炮制方法混乱、物质成分不清晰等问题，严重影响了鲜竹沥临床用药的安全性和有效性。
中药的临床疗效取决于其所含化学成分（群）的特征，采用多种分析技术手段构建整体质量评价体系成为近年来中药标准化的发展方向。中药质量标志物（qualitymarker，Q-Marker）是刘昌孝院士[5]近年来提出的中药质量评价与质量控制的核心概念，其基于有效、特有、传递与溯源、可测和处方配伍的“五原则”[6]，目前已用于药材、饮片、复方Q-Marker的研究。Q-Marker概念的提出，为中药的质量控制研究指明了方向，为后续研究中药发挥作用的机制奠定了基础。
网络药理学是建立在系统生物学和网络生物学基础上的研究方法，能够推动对药物作用机制的认识，加速药物靶点筛选以及生物标志物的发现[7-8]，清华大学李梢教授于年首次以“网络靶标”为特点进行了一系列开拓性探索[9]；年提出中药方剂发挥“多因微效”的整体疗效调节作用机制[10]；年利用生物信息学方法首次构建出中医寒热证生物分子网络及其网络调节效应及框架[11-13]，年提出中药网络药理学的理论、方法论与应用，并使用网络药理学方法进行中药复方作用机制解析的研究工作[14]，随着网络药理学的影响力和应用日益广泛，研究者通过运用各大数据库进行药物与疾病相关靶点信息的搜集、预测与筛选，构建药物-靶点-疾病相互作用网络，进行靶标基因富集分析，从分子机制方面揭示成分在疾病预防或治疗方面发挥效用的途径，阐明中药“多成分-多靶点-多途径”的治疗特点[15]，是解析药物及治疗对象之间的分子关联规律，符合中医药特色的科学研究方法。
鲜竹沥作为临床上常用止咳、平喘、祛痰的中药，其功效已明确，但该中药发挥治疗作用的药效物质基础、作用机制却不甚清晰，因此本研究从Q-Marker的“五原则”出发，通过对鲜竹沥的目标化学成分的潜在病症靶点进行映射，结合传统功效进行分组，结合网络药理学方法，从化学和生物信息角度预测分析鲜竹沥功效的潜在Q-Marker及分子机制，为鲜竹沥的质量控制及后续研究开发提供参考。
1材料
1.1仪器
A/C型气质联用色谱仪（GC-MS，美国Agilent公司）；MS-DU型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-B型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；H-W型台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；TD1C型电子天平（天津天马衡基仪器有限公司）。
1.2药品与试剂
竹子采自江西南昌湾里区，经江西中医药大学曹岚副教授鉴定为2～3年生禾本科刚竹属毛竹P.heterocycla(Carr.)Mitfordcv.Pubescens的茎秆。对照品愈创木酚（质量分数%，批号491-）、苯甲酸（质量分数99.9%，批号419-）购自中国食品药品检定研究院；4-乙基愈创木酚对照品（质量分数≥99%，批号Y03M8C）购自上海源叶生物科技有限公司；对照品醋酸（批号CHB）、糠醛（批号CHB）、糠醇（批号CHB）、4-甲基愈创木酚（批号CHB）、对乙基苯酚（批号CHB）、对乙烯基愈创木酚（批号CHB）、紫丁香醇（批号CHB）、二氢丁香酚（批号CHB）、香兰素（批号CHB）、香草酸（批号CHB）、丁香醛（批号CHB）购自成都克洛玛生物科技有限公司，质量分数均≥98%；乙腈、甲醇（色谱纯）购自德国Merck公司；纯净水购自杭州娃哈哈集团有限公司；其他试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
2方法
2.1GC-MS方法
2.1.1色谱条件-AglientDB-毛细管色谱柱（30m×μm×1.8μm）；载气为氦气，柱体积流量为1.0mL/min；进样口温度为℃；分流比5∶1；程序升温：起始温度30℃，保持5min；以3℃升温至40℃，保持4min；以5℃/min升温至60℃，保持2min；以10℃/min升温至80℃，保持2min；以10℃/min升温至℃，保持3min；以5℃/min升温至℃，保持2min；以5℃/min升温至℃，保持0min；以3℃/min升温至℃，保持0min；以8℃/min升温至℃，保持1min；以5℃/min升温至℃，保持0min；进样量为1.0μL。
2.1.2质谱条件四极杆温度℃；电离源为标准电子轰击源（EI），离子源温度℃；电子倍增管电压.06V；扫描范围m/z50～。
2.2样品制备
2.2.1干馏法选取2～3年生毛竹，锯成约40cm段，去节，将其置于干馏装置内，固定温度，从竹沥滴出开始计时，收集鲜竹沥液，于4℃保存。
2.2.2火烤法选取2～3年生毛竹，锯成约40cm段，去节，用酒精喷灯加热中部，收集两端流出的竹沥，烤至竹变黑且无汁液流出，收集鲜竹沥液，于4℃保存。
按以上方法各制备8批（S1～S8）鲜竹沥样品。
2.3供试品溶液的制备
取样品5mL，用萃取剂二氯甲烷（色谱级）以1∶1萃取2次，静置20min，分层后取下层，合并萃取液，过0.45μm微孔滤膜，于4℃保存，即得。
2.4对照品溶液的制备
精密称取对照品愈创木酚、苯甲酸、4-乙基愈创木酚、醋酸、糠醛、糠醇、4-甲基愈创木酚、对乙基苯酚、对乙烯基愈创木酚、紫丁香醇、二氢丁香酚、香兰素、香草酸、丁香醛适量，以甲醇溶解，得到适宜质量浓度的混合对照品溶液。
2.5指纹图谱建立及相似度评价
各取8批干馏法、火烤法制得的鲜竹沥，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下方法进行检测，记录鲜竹沥色谱图，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统（年版）软件，以S8的指纹图谱作为参照图谱，采用平均数法，进行多点校正和色谱峰匹配，自动匹配生成指纹图谱共有模式。相似度评价结果，并对鲜竹沥的不同制备工艺的共有成分进行筛选。
2.6鲜竹沥成分筛选方法
通过比对指纹图谱鲜竹沥2种工艺下的物质成分，发现共有峰，并结合TCMSP中药系统药理数据库（
